生物医学成像和工业计量的照明系统规格通常集中在光谱、空间和时间的光输出特性上。Lumencor的技术支持总监Iain Johnson和我们分享了固态光源阵列——LED、发光管和激光器组合成的固态光引擎如何实现规格定制，以满足特定应用的照明要求。
从实验室到生产线：固态光源技术在生物成像与工业检测中的性能提升
生物医学成像和工业计量的照明系统规格通常集中在光谱、空间和时间的光输出特性上。Lumencor的技术支持总监Iain Johnson和我们分享了固态光源阵列——LED、发光管和激光器组合成的固态光引擎如何实现规格定制，以满足特定应用的照明要求。
固态光引擎是一个集中控制的固态光源阵列，其输出合并到一个共同的光学传输系统中（图1）。光源的输出可以并行激活以产生白光（图2），或在需要分离的波长时，也可按顺序进行激活（图3、图4）。光源本身可以采用一种固态照明技术，即LED、光导管或半导体激光器，也可以对这些光源技术进行组合。这可以根据zui终用户的应用对亮度、角度分布和辐照度的要求进行定制。根据这一定义，光引擎输出的光谱分布可以通过加法组合，而这与传统的宽光谱照明设备（电弧放电和白炽灯）形成鲜明对比。传统的照明设备产生的光谱分布在物理上是不变的，只能通过选择性的阻挡和衰减来调整。从工程学的角度来看，固态光源的第二个主要优点是，它的输出可以在强度（图2、图4）和时间（图4、图5）方面进行精确控制。因此，光谱输出单元件的差异很小（图2），这使得光引擎应用于不同成像系统时，所获得的数据质量能保持一致。
图1.固态光引擎及其输出光谱的概念图。四个固态光源的输出被合并入一个共同的光路，并通过光导耦合进入纤维及或者图像扫描仪。在实际操作中，光源可以是2-21个，具体数量取决于应用要求。光源可以是LED、光导管或半导体激光器其中的一种或组合。它们的输出可以经过滤波（F）以细化光谱。输出光的一部分会被分离出来，并导向参考光电二极管（rPD），以提供控制反馈。
在大多数生物医学成像应用中，不需要持续照明，甚至在某些情况下，会起到反效果，影响实验数据。通常情况下，照明与相机曝光会同步进行。这里有两个重点：首先是光源间的切换速度，其次是脉冲间隔的复现性。相比和机械滤光轮耦合的白光照明器（约50ms的切换时间），光引擎可以做到小于1ms的光源间切换（图4），缩短了获取多色图像Z轴堆叠或者玻片扫描所需的时间。脉冲间的积分不变形（图5）是决定延时图像序列保真度的关键因素。每个脉冲的积分量化了在延时序列中每次曝光所需的照度。脉冲之间的照度差异越小，样品动态行为的敏感度就越能增加，这在图像帧到帧的变化间可以体现。
图2.28台SOLA V-nIR光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR）的光谱输出曲线叠加。光引擎的总光输出由光谱曲线所包围的区域来量化。所有28台光引擎的平均输出功率为4558mW，标准差（n=28）为91mW，相当于2%的方差系数（CV）。
图3.SPECTRA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR）的光谱输出，包括LED、发光管或激光器。发光二极管和光导管的波长规格（nm）代表了中心波长（CWL）/半高全宽（FWHM），已经通过内置的滤光片来改进光源输出。功率（mW）是在光导（连接到显微镜或光学扫描仪）的远端测量得到的。
集成三种不同类型的固态光源，可以在整个可见光和近红外波段内提供均匀的功率输出。
图4.由TTL触发，AURA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR）交替输出485nm（约0.5ms宽）和560nm（约3ms宽）的脉冲（示波器记录）。图中显示了两条叠加的示波器轨迹，其中485nm的强度通过RS232串行命令从100%调整到55%，而560nm的强度保持不变。485nm和560nm的脉冲时间间隔为0.25ms。
图5.模拟光电二极管（APD）检测来自一台5光源的AURA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR）发出的5ms光脉冲。图中展示了10个脉冲序列，代表了每次数据采集中记录的150个连续脉冲。计算了150个脉冲序列中每个脉冲的积分光输出。对于555/28 nm输出，150个脉冲的方差系数（CV）在555/28 nm脉冲串中为0.23%，在635/22 nm脉冲序列中为0.20%。其他三个源通道的CV值相似（0.15-0.25%）。
除了光谱带宽（图3）以外，固态LED、光导管和激光器之间的主要区别在于其光输出的角度分布；LED和激光器之前的zui大区别如表1所示。对于宽场显微镜应用，LED光源配置为科勒照明产生的均匀照明，辐照度范围为1-100mW/mm2。然而，单分子定位显微镜（SMLM）需要更高的辐照度，通过链接到显微镜临界落射照明器（critical epilluminator）的CELESTA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR），可以在样品表明提供10^4mW/mm2的辐照度（图6）。临界照明的使用是由科勒照明在光学上的低效率所决定的，因为科勒照明并没有覆盖整个光源表面或者发射光的全部角度分布。在临界照明中，光源被直接成像到样品平面上，这种方法更为高效，但对光源输出中的任何空间不均匀性也更为敏感。临界落射照明器的作用是均匀化任何空间上的不均匀性，以产生与典型scmos相机传感器尺寸（~200mm2）相匹配的高辐照度照明场。
Light Source | Power(mW)① | light guide ② | Light Guide Cross Section | Area(mm2) | NA ③ | Etendue (mm2 sr)④ |
LED | 500 | Liquid light guide | Circle, 3mm dia | 7.07 | 0.30 | 2.00 |
Laser | 800 | multimode fiber | Square, 0.4*0.4mm | 0.16 | 0.22 | 0.02 |
表1. 光源比较
①输出功率是在指定光导的远端测量的
②使用光导将光源输出耦合到显微镜或光学扫描仪
③光导的数值孔径
④光通量积决定了光学检测系统有效利用光源输出的能力。当光源的光通量积与光学系统的光通量积紧密匹配时，可以获得zui佳性能。sr=球面弧度。
针对光驱动生物技术以及工业应用，优化光源的选择性需要全面考虑仪器的光谱、空间和时间要求，这些正是需要照明光源来支持的。通常一种技术尽可以满足其中的部分要求，所以zui佳策略即是混合多种技术来满足全部需求。复杂的光引擎可以提供这样一种集成的方法来混合光源，并克服任何给定技术的基本限制，例如，在荧光分析中，LED在500-600nm的光中由于臭名昭著的“绿色间隙”功率和亮度往往无法满足；或者相对于毫秒级的切换时间，任何弧光灯的开/关不稳定性；又或者广谱光源进行多路复用研究时，谱宽也带来了限制。如今各种固态光源各有优劣，只有仔细评估它们的优点与局限性，才能为光驱动生命和材料科学应用的广泛领域找到zui合适的照面解决方案。
图6.使用CELESTA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR），通过一根直径800um的光纤耦合到安装在尼康Ti/Ti2显微镜的临界落射照明器上，并产生均匀的荧光玻璃成像。使用尼康60/1.4 NA Plan Apo物镜和Andor的 Zyla 5.5 (2560 x 2160 pixels) scmos相机进行图像捕捉。图表显示了相机沿着标记为红色的对角线所记录的灰度值。右上角的插图展示了使用尼康10X/0.3 NA Plan Apo物镜成像的同一样品。
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